Na pobrania z dziećmi zapraszamy w każdy wtorek.

Facebook iconInstagram iconLinkedin icon
Twoje kontoKoszyk

Metody

Tło dla sekcji informacyjnej: Metody
Strona główna / Strefa medyczna / Metody
    Metoda referencyjna, uznawana obecnie za "złoty standard" w diagnostyce alergii. Umożliwia oznaczanie stężenia specyficznych przeciwciał IgE (sIgE) w próbce surowicy Pacjenta, skierowanych przeciwko określonemu alergenowi (składnikowi ImmunoCAP-a) dzięki zastosowaniu przeciwciał znakowanych enzymem, odczynnika wywołującego reakcje fluorescencji i odczycie wyemitowanego światła. Im wyższa wartość "świetlnej" odpowiedzi, tym więcej swoistych IgE znajduje się w próbce. W celu oceny wyniku badania, pomiar fluorescencji dla próbki Pacjenta jest przekształcany na stężenie na podstawie danych z krzywej kalibracyjnej.

FEIA-CAP (ImmunoCAP)

Metoda referencyjna, uznawana obecnie za "złoty standard" w diagnostyce alergii. Umożliwia oznaczanie stężenia specyficznych przeciwciał IgE (sIgE) w próbce surowicy Pacjenta, skierowanych przeciwko określonemu alergenowi (składnikowi ImmunoCAP-a) dzięki zastosowaniu przeciwciał znakowanych enzymem, odczynnika wywołującego reakcje fluorescencji i odczycie wyemitowanego światła. Im wyższa wartość "świetlnej" odpowiedzi, tym więcej swoistych IgE znajduje się w próbce. W celu oceny wyniku badania, pomiar fluorescencji dla próbki Pacjenta jest przekształcany na stężenie na podstawie danych z krzywej kalibracyjnej.

Metoda fluoroimmunoenzymatyczna (zestawy EliA)

Studzienki zestawu EliA opłaszczane są ludzkimi rekombinowanymi antygenami właściwymi dla wykonywanego testu. Detekcja odpowiednich przeciwciał w próbce badanej po ich związaniu z antygenami w studzienkach możliwa jest dzięki zastosowaniu koniugatu (anty-przeciwciała znakowanego enzymem), utworzeniu kompleksu koniugat - przeciwciało, dodaniu odczynnika wywołującego emisję światła i pomiaru fluorescencji eluatu. Fluorescencja jest wprost proporcjonalna do stężenia przeciwciał w badanej próbce. W celu oceny wyniku, pomiar fluorescencji dla próbki Pacjenta, jest porównywany do krzywej kalibracyjnej wykreślonej z wyników fluorescencji kalibratorów.

Polycheck

Polycheck® to nowoczesny system (wieloparametrowe bloty) do ilościowego oznaczania swoistych przeciwciał IgE (sIgE) w surowicy krwi. W metodzie tej zastosowano: kompleksowe profile antygenów (alergenów) na jednym pasku testowym, indywidualną 5-cio punktową krzywą kalibracyjną do każdego testu w czasie rzeczywistym, 3 lub 5 kontroli pozytywnych i 1 kontrolę negatywną, ludzkie przeciwciała IgE w kontrolach oraz wysoce specyficzne przeciwciała monoklonalne. Jeśli w badanej próbce znajdują się specyficzne przeciwciała, wiążą się one z antygenami na pasku testowym, kolejno dodawane jest przeciwciało (koniugat) znakowane enzymem, katalizującym reakcję barwną z dodanym w następnej kolejności substratem. Jeśli w próbce Pacjenta obecne są specyficzne przeciwciała, w pozycji odpowiedniej dla danego antygenu pojawia się ciemna linia. Intensywność uzyskanego barwienia jest proporcjonalna do stężenia przeciwciał w próbce.

Immunoblot

W celu wykrycia specyficznych przeciwciał w próbkach Pacjentów jako fazę stałą wykorzystuje się antygeny opłaszczone na membranach (testy multipleksowe). Jeśli próbka zawiera specyficzne przeciwciała, wiążą się one z antygenami na membranie. W kolejnym etapie dodawane jest przeciwciało (koniugat) znakowane fosfatazą alkaliczną (AP), które wiąże się ze swoistymi przeciwciałami. Fosfataza alkaliczna katalizuje reakcję barwną z dodanym w następnej kolejności substratem. Jeśli w próbce Pacjenta obecne są specyficzne przeciwciała, w pozycji odpowiedniej dla danego antygenu pojawia się ciemna linia. Intensywność uzyskanego barwienia jest proporcjonalna do stężenia przeciwciał w próbce.

Metoda immunoenzymatyczna (ang. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)

Technika immunoenzymatyczna (ELISA) jest jedną z najpopularniejszych technik zarówno diagnostycznych jak i naukowych, charakteryzująca się dużą czułością, stosowana m.in. w badaniach przesiewowych. Metoda przeprowadzana jest na 96-dołkowych płytkach titracyjnych (polistyrenowych/ polipropylenowych) opłaszczanych preparatami antygenowymi (lub przeciwciałami). Metoda wykrywania p/ciał przebiega według następujących etapów: • przyłączenia się przeciwciała (materiał Pacjenta) do antygenu związanego z fazą stałą, • inkubacja, płukanie (wypłukanie niezwiązanych p/ciał) oraz dodanie koniugatu (p/ciała znakowanego enzymem, np. peroksydazą chrzanową, fosfatazą alkaliczną), dzięki czemu powstaje kompleks (faza stała-antygen-p/ciało-koniugat), • dodanie substratu (odpowiednio t-metylobenzydyny dla peroksydazy chrzanowej, p-nitrofenylofosforanu dla fosfatazy alkalicznej), • enzym katalizuje przemianę substratu do produktu, którego ilość jest proporcjonalna do stężenia p/ciał w próbce, • po zahamowaniu reakcji (przez zastosowanie np. H2SO4) następuje pomiar spektrofotometryczny absorbancji, a stężenie badanych p/ciał odczytuje się przez porównanie z krzywą kalibracyjną w testach ilościowych i na wartość stosunku w testach półilościowych.

Metoda immunofluorescencji pośredniej (II FT)

Metoda immunofluorescencji pośredniej (ang. indirect immunofluorescence - IIF) jest podstawową techniką immunopatologiczną służącą do wykrywania w surowicach Pacjentów autoprzeciwciał krążących, najczęściej stosowaną w reumatologii jako element diagnostyki przesiewowej (wstępnej). W pierwszym etapie badania nanosi się na substrat (najczęściej rozmaz komórkowy, skrawek tkanki) odpowiednio rozcieńczoną surowicę Pacjenta. Jeżeli w badanej próbce znajdują się specyficzne przeciwciała, dochodzi do reakcji antygen-przeciwciało. W drugim etapie dodawany jest koniugat (przeciwciało antyludzkie znakowane barwnikiem fluorescencyjnym, izotiocyjanianem fluoresceiny, FITC - fluorescein isothiocyanate). W efekcie pod mikroskopem fluorescencyjnym obserwuje się charakterystyczne wzory fluorescencji. Typ świecenia zależy od morfologicznej lokalizacji docelowego antygen. Technologia BIOCHIP opracowana przez EUROIMMUN zapewnia niezrównaną jakość i różnorodność wśród testów opartych o IIFT. Dzięki specjalnej technice, szkiełka nakrywkowe są modyfikowane w sposób, dzięki któremu różne substraty mogą być powlekane na ich powierzchni. Jako substraty używane są m.in. komórki hodowlane, skrawki tkanek, komórki transfekowane i wysokooczyszczone antygeny (EUROPLUS). Szkiełka nakrywkowe pokryte substratami są następnie cięte mechanicznie na milimetrowe fragmenty (BIOCHIP-y). BIOCHIP-y są mocowane precyzyjnie w polach testowych na specjalnie opracowanych plastikowych szkiełkach mikroskopowych. Kiedy wiele BIOCHIP-ów pokrytych różnymi substratami jest ułożonych w jednym polu reakcyjnym, można jednocześnie badać przeciwciała przeciwko różnym narządom lub czynnikom zakaźnym. Takie mozaiki BIOCHIP umożliwiają generowanie kompleksowych profili przeciwciał (multipleks) przy minimalnych objętościach próbek badanych lub wzajemną weryfikację wyników na różnych substratach.

Metoda chemiluminescencyjno-immunologiczna (ang. Chemiluminescent immunoassay, CLIA)

W metodzie chemiluminescencyjno-immunologicznej badany materiał mieszany jest z mikrocząstkami magnetycznymi opłaszczonymi antygenami bądź p/ciałami w zależności od oznaczanego parametru, koniugatem (p/ciałem znakowanym enzymem, np. akrydyną, fosfatazą alkaliczną), rozcieńczalnikiem testu i roztworem rozwijającym reakcję chemiluminescencji. Natężenie sygnału powstałego w reakcji chemiluminescencji porównywane jest z wartością natężenia sygnału dla punktu odcięcia (jakościowa ocena parametru) lub z krzywą kalibracyjną (ilościowa ocena parametru).

Cytometria przepływowa (ang. Flow cytometry)

Cytometria przepływowa identyfikuje i zlicza podzbiory komórek, jednocześnie mierzy, a następnie analizuje wiele fizycznych cech pojedynczych cząsteczek, w czasie, gdy przepływają one w strumieniu płynu przez wiązkę światła. Mierzone właściwości obejmują względny rozmiar cząsteczki, jej względną ziarnistość lub wewnętrzną złożoność oraz względną intensywność fluorescencji. Sprzężony układ optoelektroniczny pozwala ocenić te cechy poprzez rejestrowanie, w jaki sposób komórka lub cząsteczka rozprasza padające światło lasera i emituje fluorescencję. Fluorochrom koniugowany z przeciwciałem wykorzystywany jest do identyfikacji konkretnego typu komórki w oparciu o jej indywidualne markery antygenowe. Technologia cytometrii przepływowej znajduje zastosowanie m. in. w diagnostyce immunologicznej (niedobory odporności, diagnostyka alergii, diagnostyka schorzeń autoimmunologicznych, ocena subpopulacji limfocytów) czy diagnostyce onkohematologicznej (fenotypowanie komórek białaczkowych i chłoniakowych).

Impedancja z ogniskowaniem hydrodynamicznym

Metoda impedancji z ogniskowaniem hydrodynamicznym to technika detekcji stosowana w automatycznych analizatorach hematologicznych do zliczania komórek krwi, szczególnie erytrocytów i trombocytów. W tej metodzie rozcieńczona próbka krwi wprowadzana jest z dyszy do komory stożkowej, otaczana jest przed odczynnik osłonowy, przechodzi przez środek szczeliny po czym wysyłana jest do przewodu wyłapującego. Metoda ogniskowania hydrodynamicznego zapobiega cofaniu się komórek krwi i powstawaniu fałszywych sygnałów, zwiększając dokładność analizy jak również powtarzalność wyników.

Metoda SLS-HGB

Metoda oznaczania hemoglobiny z użyciem siarczanu laurylu sodu (SLS-HGB) wykorzystuje siarczan laurylu sodu (SLS) do pomiaru stężenia hemoglobiny we krwi pełnej. Mechanizm powstawania reakcji SLS-hemoglobina obejmuje hemolizę krwinek czerwonych spowodowaną reakcją błony krwinek z SLS, zmianę w strukturze III-rzędowej cząsteczki globiny, utlenienie żelaza hemowego przez tlen oraz przyłączenie SLS z wytworzeniem stabilnego kompleksu SLS-HGB. Analizator prześwietla próbkę falą długości 555 nm i mierzy absorbancję. Wartość HGB stanowi różnicę absorbancji światła w rozcieńczalniku (wartość tła) i absorbancji światła w próbce badanej krwi. Metoda ta jest szybka, precyzyjna i wykorzystywana powszechnie w automatycznych analizatorach hematologicznych.

Fotometria/ISE

Metody fotometrii oraz jonoselektywnych elektrod membranowych (ISE) to techniki analityczne stosowane w nowoczesnych analizatorach biochemicznych do pomiaru stężeń różnych substancji chemicznych (substraty, enzymy, białka specyficzne) w próbkach biologicznych, takich jak surowica krwi. Fotometria wykorzystuje zjawisko emisji światła przez związki chemiczne w próbce, gdzie intensywność światła po przejściu przez próbkę jest mierzona i przeliczana na stężenie analizowanej substancji. Z kolei metoda ISE (ang. Ion Selective Electrode) polega na zastosowaniu elektrod z charakterystyczną membraną, która wybiórczo oddziałuje z jonami zawartymi w badanym materiale. Elektrody o których mowa cechują się wysoką selektywnością, zatem ich potencjał zależy od aktywności jednego jonu. Takie elektrody są najczęściej stosowane w potencjonometrii, metodzie nacechowanej dużą szybkością, prostotą wykonania pomiaru oraz łatwością automatyzacji. Połączenie obu metod w jednym analizatorze pozwala na kompleksowe oznaczenie różnych parametrów biochemicznych z dużą dokładnością i powtarzalnością.

ECLIA

Elektrochemiluminescencja (ECLIA) to metoda analityczna stosowana do wykrywania i ilościowego oznaczania substancji występujących w niewielkich stężeniach w materiale badanym, takich jak hormony, białka, markery chorób zakaźnych, markery nowotworowe czy autoprzeciwciała. Metoda ta łączy reakcje chemiluminescencji z procesami elektrochemicznymi. W technice ECLIA, analit (substancja będąca przedmiotem badania) reaguje z reagentem znakowanym specjalnym luminoforem (cząsteczką luminescencyjną), który pod wpływem napięcia przyłożonego do elektrody indukuje reakcję chemiluminescencji i emisję fotonu mierzonego za pomocą fotopowielacza. Pomiędzy emisją światła a stężeniem badanej substancji w próbce występuje najczęściej proporcjonalna zależność. Wysoka czułość i swoistość metody sprawiają, że ECLIA jest szeroko stosowana w immunodiagnostyce klinicznej.